摘要

本文首次描述了一种与磷脂质相关的高通量荧光。阴离子两亲磷脂可以在水溶液中形成复合物，其临界胶束浓度(CMC)可以使用荧光探针N,N-二甲基-6-丙酰-2-萘胺(Prodan)测定。在与候选药物相互作用时，由于脂质和候选药物之间的关联，该CMC可能会转变为较低的值，相互作用越强，转变越大。药物的代谢可以根据代谢速率和代谢物的性质改变磷脂质的程度。我们使用这种荧光方法从45种药物和10种药物的代谢物获得的数据证明了与人体研究、体内测试和细胞分析报告的磷脂沉积症有良好的相关性。因此，该测定提供了一种快速、可靠且具有成本效益的筛选工具，用于早期预测候选药物的磷脂沉积诱导潜力。

药物诱导的磷脂病(PLD)，虽然不这么叫，但在1948年Nelson和Fitzhugh首次报道了长期服用氯喹的大鼠的泡沫巨噬细胞。1后来的研究表明，阳离子两亲药物（CADs)负责诱导细胞中的这种脂质积累，并导致存在主要成分为溶酶体的层状包涵体。2-5 PLD背后的机制尚不完全清楚。两个主要假设包括(i)CAD和磷脂之间通过疏水和静电相互作用结合，导致溶酶体磷脂酶无法消化药物脂质复合物，以及(ii)CAD直接抑制脂质消化酶。3，6-9没有明确的证据表明药物诱导的PLD与细胞毒性有关。这种脂质储存障碍被认为是细胞对CAD暴露的适应性反应10而不是毒理学表现，并且在给药终止后是可逆的。11,12由PLD引起的脂质代谢改变值得关注，因为它可能发生在包括肺、肝、脑、神经系统和淋巴系统在内的一系列组织类型。13在某些情况下，它会导致药物和/或其代谢物在层状体中积累高达毫摩尔浓度并导致细胞损伤。2,14因此，研究了化合物对PLD可逆性的程度和持续时间，以评估其安全范围。在PLD的诊断中，需要通过透射电子显微镜(TEM)进行确认，这被广泛接受为表征药物诱导的脂质沉积的标准方法。9,15-18在TEM下，巨噬细胞中的洋葱样溶酶体是PLD的特征。然而，由于TEM成本高、需要牺牲实验动物，以及研究与研究在实验设计、剂量等方面的差异，TEM既不常见，也不容易满足早期药物发现和开发的要求。已经开发了诸如计算机评估、体外生物筛选和体内生物标志物等工具来满足药物发现和开发不同阶段的需求，以预测或识别磷脂质沉积症。由于CAD的特性，PLD的计算机模拟预测模型侧重于筛选候选物的亲脂性及其在中性13,19或较低pH值下的电荷，代表溶酶体中的条件。20后来的模型还包含详细的化合物结构信息13或药代动力学特性以提高可预测性。10虽然可用作第一层标记工具，但计算机模型应谨慎使用，因为它们可能会投影PLD快照，尤其是对于虚拟分子，而不是完整的机械评估，包括剂量依赖性和时间依赖性。此外，这些工具无法预测非CAD诱导剂，例如高度亲水的庆大霉素。21

图1.用在不同检测日期获得的不同测试物品的平均CMC说明检测的重现性。误差棒代表标准偏差。

在大多数制药公司的PLD筛选策略中，下一级筛选分析是基于细胞的生物分析，在细胞内使用荧光脂质或亲脂性染料。22-25最近报道了一种基于96孔的基因表达分析26；然而，该测定已被证明不太敏感。22直到最近，还没有基于非细胞的体外筛选测定可用。已经报道了一种高通量langmuir-balance方法，将用测试化合物处理后临界胶束浓度(CMC)的变化与在人类、动物和细胞中观察到的PLD联系起来。27这种方法大大提高了预测质量与计算模型相比，与细胞分析和动物模型相比，增加了吞吐量；然而，这种方法需要使用专门的设备，即八通道表面张力计（Delta 8，摩登7 Inc.，Helsinki，Finland），这在大多数实验室中并不容易获得。

在本报告中，我们描述了一种用于测定CMC的替代方法，因此与langmuir平衡方法相一致，药物的磷脂生成潜力。我们使用荧光染料探针通过短链脂质的CMC变化来测量药物脂质复合物的形成。一些荧光染料探针长期以来一直用于测定CMC，28,29包括脂质30,31，这是基于影响染料探针荧光发射的胶束形成后的微环境变化。所需的仪器是大多数生物学和生物化学实验室都有的荧光读板仪。

药物代谢至少可以通过两种方式影响PLD。当形成CAD的极性代谢物时，它可以迅速排出体外，从而减少母体积累的可能性。另一方面，来自非CAD母体的阳离子两亲代谢物的形成也可以诱导PLD。32这种机制见解可能有助于解释体外筛选结果与体内动物数据之间的脱节。出于这个原因，我们还研究了一些测试化合物的主要代谢物的磷脂生成潜力。

Delta-8使用新方法测试CMC，而不是表面张力测试法——摘要

Delta-8使用新方法测试CMC，而不是表面张力测试法——方法

Delta-8使用新方法测试CMC，而不是表面张力测试法——结果

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