结果和讨论

首先，给出了从表面压力测量中获得的压缩等温线，揭示了水、钠和钙溶液中脂质单层之间的宏观差异。然后，我们使用荧光显微镜沿着压缩等温线观察了结构域的形成，并跟踪了当Ca2+离子结合到单层时结构域的变化。最后，利用VSFG在分子水平上阐明了阳离子-脂质相互作用。

压缩等温线。图2显示了DPPC和DMPS单分子膜在不同亚相（净水、1 M NaCl和1 M CaCl2溶液）上的Langmuir等温线。对于此处使用的1 M NaCl和1 M CaCl2溶液，亚相中的氯离子浓度不同。由于氯离子与磷脂的配位作用较弱，因此可以忽略因氯离子浓度不同而产生的11种可能影响，这已通过使用0.5 M CaCl2溶液的对照实验得到证实。

图2：DPPC（A）和DMPS（b）在不同亚相上的压力面积（π-A）等温线：净水（蓝色）、1 M NaCl溶液（绿色）、1 M CaCl2溶液（红色）。沿等温线显示了液相膨胀相（LE）、液相凝聚相（LC）和两相共存区（LE+LC）。ACa2+代表钙离子的面积。

在水上，DPPC的相行为已被充分记录。23,25随着表面积的减小，已确定以下区域：气相、液相膨胀（LE）相、LE和液相冷凝（LC）相共存的平台特征以及纯LC相。

由于亚相中存在钠离子，DPPC的压缩等温线在LE和LE+LC区域移动到略高的表面压力。之前也观察到了同样的效果30，这可以通过离子结合到LE相引起的脂链紊乱来解释。在较高的表面压力下，钠对压缩等温线没有影响，表明钠离子与LC相没有明显的相互作用：离子可能正从头群区域“挤出”。

对于CaCl2溶液亚相，观察到更显着的效果。在这里，表面压力在低得多的密度下变得有限(∼140Å2/分子），而从LE相到LE+LC共存区的转变不太明显。在LC区域（π>20 mN/m），钙的存在导致脂质占据4Å2/m的额外空间，这正是钙离子的足迹。31这表明，在表面压力超过20 mN/m时，使头部基团水合的水被钙离子取代。在更高的表面压力（>25 mN/m）下，额外面积下降约2Å2/脂。分子面积差异的变化可以用两种方式来解释：（1）从1:1到2:1脂质/Ca2+复合物的转变，正如之前MD模拟所提出的那样；11（2）脂质头基构象的变化。6,23

对于DMP，水上压缩等温线（图2b）显示出与DPPC相同的相行为，具有LE、LE+LC和LC区域。然而，压缩后，每个分子可以达到更小的面积。这表明PS比PC更具可压缩性，这与相邻带电头基团之间的库仑排斥作用应扩大每个PS分子面积的直观表示相反。结果表明，相邻PS头基带电部分的强分子间配位在面积减小中起作用。16

对于1 M Ca2+溶液上的DMPS单分子膜，与观察到的纯水共存区的π）10 mN/M压力相比，LE+LC平台压力降低到π）5 mN/M；在较高的表面压力（π>20 mN/m）下，两条等温线的位移保持等于Ca2+足迹，4Å2/脂，未观察到明显转变为2:1脂/Ca2+复合物。

荧光显微镜。利用荧光显微镜可以观察到脂质单分子膜内的共存相。图3显示了三种典型表面压力下，用荧光探针标记的DPPC和DMPS单分子膜沿等温线获得的荧光图像。暗区对应于有序（LC）畴，亮区对应于无序（LE）畴。对于净水子相（图3中的左列），低表面压力下的LC域为DPPC（图3a）19的“豆”形和DMP的“花”形（图3d）。随着表面积的减少，LC域在凝聚成连续LC相（图3c）之前通过有序脂质的狭窄区域相互连接（图3b）33。从荧光图像分析中获得的有序暗区的归一化面积Adark（图4）表明，LC相在单层压缩后增加，并在π>10 mN/m时覆盖整个单层。

图3：水上DPPC（a、b、c）和DMPS（d）单层的荧光图像（左图）和1 M CaCl2溶液（右图），π）4 mN/M（a）、π）6.5 mN/M（b）、π）35 mN/M（c）和π）2 mN/M（d）。单分子膜用5 mol%罗丹明PE标记：亮区对应于LE相，暗区为LC结构域。比例尺代表15µm。所有图像的对比度都相同。

当钙存在于亚相时，PC和PS单分子膜在低表面压力下都可以观察到小的有序畴。更大面积的单层被这些∼与水相比，Ca2+的有序畴为3.5µm（见图4）。因此，低表面压力下的这些小区域是钙诱导的，它们占据∼表面的30%（对于PC）和20%（对于PS）。从下面的VSFG测量中也可以明显看出这些域的存在。到目前为止，这种钙离子诱导的结构域仅在混合单层系统中观察到。34,35在中等表面压力下（5 mN/m<π<25 mN/m），从图4可以明显看出，Ca2+的作用是降低有序畴的密度。

图4：。在净水（蓝色）和1 M CaCl2溶液（红色）上，DPPC（a）和DMPS（b）单分子膜的荧光图像中暗有序LC域的部分面积Adark随表面压力的变化。注意周围标记的局部最大值∼在存在Ca2+离子的情况下，两种脂质均为3 mN/m。

振动和频发生光谱学（VSFG）。VSFG是一种非线性振动光谱技术，可提供界面分子构象顺序和方向的表面特定信息，进一步研究了在Ca2+存在下这种改变相行为的分子起源。21,22为了量化离子对脂质尾部构象的影响，在C-H拉伸区域收集VSFG光谱。沿等温线测量了几个表面压力的光谱；图5显示了DPPC单层在20 mN/m和35 mN/m下三种不同亚相的光谱。可以观察到五种振动模式：以2876、2970和2938 cm-1为中心的峰值分别归属于CH3对称拉伸、CH3反对称拉伸和CH3费米共振。22 CH2对称和反对称拉伸频率约为2846和2920 cm-1。氘化DPPC脂质单层（d62和d75 DPPC）上的VSFG实验显示胆碱C-H伸展的信号非常低。

图5：。DPPC在π）20 mN/m（顶板）和π）35 mN/m（底板）时的VSFG光谱。垂直线表示亚甲基对称拉伸（νsCH2）和甲基对称拉伸（νsCH3）的位置。所有光谱均归一化为z切石英的参考信号。实线表示使用洛伦兹模型拟合数据。

单分子层压缩后，CH2强度显着降低。这可以从对称性参数中理解：当烷基链中的亚甲基从顺式构象变为反式构象时，会出现一个局部反转中心，从而使CH2模式SFG无效。23另一方面，CH3强度随着单层的压缩而急剧增加，这是由于链倾角的角度分布变窄所致。CH3和CH2对称拉伸振子强度可通过拟合数据获得。考虑到前面的论点，CH3和CH2对称拉伸振子强度的比值R为脂链的顺序提供了一个灵敏的经验度量。24为了可靠地提取R，使用洛伦兹多峰模型对数据进行全局分析（见支持信息中的公式2，实验部分），仅允许峰值振幅随表面压力的变化而变化。DPPC和DMPS的R在图6中绘制为表面压力的函数。

图6：。作为DPPC（a）和DMPS（b）单分子膜表面压力的函数，CH3和CH2对称拉伸振子强度的比值R：纯水（蓝色）、1 M NaCl溶液（绿色）和1 M CaCl2溶液（红色）。由于单分子膜的崩塌，在π）40 mN/m时，无法测定Na+-DPPC的比值R。由于压缩单层膜的νsCH2振幅的不确定性，在较高压力下，误差条较大。插图显示了作为每种脂质面积函数显示的比率R。请注意∼4Å2/脂质置换（解释为Ca2+足迹），与图2中的等温线一致。

对于纯水和NaCl亚相上的DPPC单分子膜，R随压力以类似的方式变化，在钠存在的情况下，R值稍小，但重复性较小。这表明，正如压区等温线也显示的那样，在Na+存在的情况下，DPPC单分子膜的有序性稍差，这与之前关于亚相中高浓度NaCl的报告一致，30但与分子动力学模拟不一致，11,13表明在∼10 mN/m表面压力。

对于含有Ca2+离子的亚相上的DPPC，R在5 mN/m处显示出一个小但可重复的峰值，随后在10到20 mN/m之间略有下降，然后在25 mN/m左右急剧增加。在低表面张力下，按顺序短暂增加(∼5 mN/m）与荧光显微镜的结果非常一致，这表明在这些压力下也会依次增加（图6）。在下文中，我们将尝试使用表面张力测量、荧光显微镜和VSFG测量的结果，提供单层相行为的统一图片。我们将首先讨论DPPC的具体结果，然后讨论DMP。

在VSFG测量中，当探测面积为∼10-2 mm2，但随着单层中平均阶数的增加，R值出现峰值。进一步压缩，诱导域合并成更大的域。同时，Adark增加，但Ca2+仍比水低20%（图4a，10 mN/m<π<25 mN/m）。这再次与VSFG光谱很好地一致，VSFG光谱表明这些表面压力下的脂质尾部更加无序，因为20 mN/m的CH2对称和反对称拉伸在亚相Ca2+中更加突出（图5）。

当表面压力达到25 mN/m时，R急剧增加，达到一个恒定的大值。有趣的是，R的急剧增加与等温线中脂质面积减少2Å2/脂质的位置一致（见图2），我们将其归因于（见上文）从1:1脂质/钙+复合物转变为2:1复合物。这意味着顺序的增加，即R的增加，涉及到由Ca2+-脂质相互作用的明显变化引起的头群的重新排列。当比较Ca2+溶液与纯水时，从R值增加的不同点也可以明显看出与Ca2+离子足迹相关的4Å2/脂质表面积。当绘制R与每种脂质的面积之比时，R的增加精确地移动了一个单位的ACa2+（插图6）。

当Ca2+-DPPC体系（π）25 mN/m的比值R急剧增大时，20%的单层面积仍被LE相覆盖。从VSFG获得的比率R的增加并不是由于脂尾中的笨拙缺陷消失，而是由于LC相中的烷基链朝向链与表面法线之间的较小角度θ重新定向。这可以从νsCH3和甲基反对称拉伸12的振幅之比得出结论（详细信息见支持信息），这表明DPPC在Ca2+溶液中的θ比在纯水中的θ小10°。在这些压力下，钙离子的存在导致脂质向表面法线协同倾斜。

对于DMP，尽管其头基结构和电荷不同，但Na+和Ca2+离子的结果与DPPC的结果非常相似。由于DMPS的非极性烃链长度略短（DMPS为14个碳，DPPC为16个碳），与DPPC相比，DMPS压缩单层的R值较低。先前已经报道了烷基链的长度与单层的相对顺序之间的直接相关性。36

对于Ca2+，DMPS单分子膜的比率R与DPPC单分子膜的趋势相似：在低表面压力下出现峰值(∼3 mN/m），并且在较高的表面压力（π）30 mN/m时会出现急剧增加，ACa2+开始向每个分子的更高面积方向移动（插图6）。同样，这与等温线数据和荧光图像非常一致。对于高表面压力（π>30mN/m）下的DMP，发现R与亚相中钙的存在无关，表明在高压下存在类似的酰基链排序。

可以注意到两种脂质之间的三个差异：首先，在5 mN/m<π<25 mN/m的区域，在荧光结果中，钙诱导的DPPC下降顺序对于DMPS是明显的，但在VSFG结果中则不太明显。其次，DPPC中观察到的从1:1到2:1脂质/钙复合物的转变对于DMPS来说并不明显，尽管ACa2+在荧光和VSFG数据中都出现。第三，虽然钠离子在高压（π>25 mN/m）下诱导两种脂质紊乱，但这种效应对DMP显着更大。目前，我们对这些观察结果没有一个令人满意的解释，除了差异必须源于集团结构的差异。

尽管DPPC和DMPS之间离子脂质相互作用的一些细节存在这些差异，但很明显，Ca2+在低表面压力下诱导两种脂质中有序结构域的形成，在中等表面压力下诱导无序结构域的形成（对于DPPC），在最高表面压力下诱导高度有序结构域的形成。对于这两种脂质，观察到明显的证据表明脂质和Ca2+之间形成复合物，但Na+不存在。钠对脂质单分子膜的影响要小得多，主要是在高表面压力下引起紊乱（最明显的是DMP）。在研究头部附近水分子的方向时，观察到两种脂质之间的其他相似性。O-D拉伸振动中D2O亚相上DPPC和DMPS的VSFG光谱（未显示数据）表明，水合水分子在阴离子和两性离子头基附近以相同的方式取向。这表明PC表现为阴离子脂质，因为DPPC的头基与其胆碱基团朝向界面。32因此，钙与PC和PS磷脂的相互作用类似并不奇怪，很可能与磷酸盐部分协调。

结论

综上所述，我们结合三种互补技术来研究阳离子对PC和PS单分子膜的影响。我们的结果表明，钠离子对DPPC单分子膜的影响很小，主要是扩张脂质单分子膜。另一方面，钙有明显的效果，这在很大程度上取决于表面压力。在低表面压力下，钙离子诱导形成小而有序的脂质结构域，随着表面压力的增加，这些脂质结构域合并成更大的脂质结构域。在高表面压力下，Ca2+对两性离子脂质和阴离子脂质单层都产生“缩合效应”，表明离子优先与脂质头基中的磷酸部分相互作用。在VSFG和表面张力测量中，Ca2+与脂质结合的分子特征从水和Ca溶液上的单分子膜之间的信号变化中可以明显看出，对应于4Å2/脂的面积变化，精确地说是Ca2+离子的表面积。

确认

这项工作是“材料粘贴voor Fundamenteel Onderzoek（FOM）”研究项目的一部分，该项目由“荷兰voor Wetenschapelijk Onderzoek（NWO）”组织资助。我们感谢本特·卡塞莫（BengtKasemo）建议进行这项实验，并感谢克里斯蒂安·蒂舍尔（Christischer）和拉杰什·皮莱（RajeshPillai）对荧光显微镜的帮助。

可用支持信息：实验部分，DMPS单分子膜的VSFG光谱，以及使用和频生成的分子取向分析。此材料可通过以下网址免费获取：http://pubs.acs.org.