3.结果和讨论

3.1.分层

为了了解空气/水表面乳清蛋白的存在和数量如何影响HFBII的表面流变性，第一步是观察纯体系和混合体系的铺展层。观察扩散层的主要优点是表面成分已知，假设几乎所有应用于界面的蛋白质都会扩散并留在界面上。图1显示了纯HFBII和纯乳清蛋白及其混合物的表面压力等温线。正如之前的研究[8,24]所知，与乳清蛋白相比，HFBII使表面压力急剧上升，其行为更像刚性颗粒，而乳清蛋白则表现出更柔软、更像聚合物的行为。据推测，由于乳清蛋白在界面处的构象变化，即展开，以及其大分子量，表面压力在较低的表面负荷下升高。然而，上升幅度远小于HFBII，乳清蛋白达到的最大表面压力也较低。关于混合层的等温线，可以观察到，对于低水平，曲线移动到稍大的表面积，曲线的形状仍然让人想起纯WPI曲线。当混合物中HFBII的比例上升到1:1或更高时，曲线的陡度增加，表面压力开始在较小的表面积处形成。另一个需要提及的重要事项是，对于纯HFBII，由于HFBII层的2D相变和凝固[11]，应注意22 mN/m以上的表面压力值，从而形成具有显著屈服应力的强弹性表面，可维持局部吸附和变形梯度[25]。因此，高于该值时，表面压力传感器附近的局部表面变形可能不同于全球平均变形。宏观上，这也表现在表面上形成褶皱，这也表明了不均匀的变形和应力分布，如下所述。

图1。纯蛋白质系统WPI（右）和HFBII（左）以及口粮WPI:HFBII为10:1、3:1、1:1、1:3和1:10的混合系统的表面压力等温线。

值得注意的是，对于纯HFBII，П–A等温线在连续的压缩膨胀循环中不会发生变化，这再次表明HFBII不可撤销地附着在界面上，几乎没有任何构象变化。对于纯WPI和1:1混合物，П–A等温线略微向较小区域移动，这表明由于WPI分子的构象变化、多层形成或如前所述，由于WPI的解吸，表面重排的可能性较小。

为了便于比较，从图1的数据中，使用表面压力第一次上升的斜率（由第一次压缩产生）和公式E=（˘2）提取了表观膨胀模量（E）−˘1）/ln（A1/A2）。曲线的斜率总是在表面压力在15到25 mN/m之间波动的表面积范围内确定的。图2显示了表观模量作为混合比的函数，表示为HFBII分数fHFBII=cHFBII/（cHFBII+cWPI）。

图2。表观模量作为扩散层HFBII分数的函数，以及槽屏障之间界面上褶皱斑块的图示。右边是纯HFBII层的一个褶皱斑的显微镜照片。

从图2中可以看出，HFBII分数高达0.5的混合层，WPI的存在似乎主导了П15至25 mN/m之间界面处的表面流变行为。仅观察到表面模量略有增加，此外，观察到界面完全光滑。从HFBII分数为0.75开始，行为开始显示HFBII层的特性。基于表观模量，从WPI主导行为到HFBII主导行为的转变对应于褶皱斑块的视觉观察，这对于压力高于22 mN/m的纯HFBII层来说是典型的。最后，在纯HFBII系统中，斑块相互连接，并观察到最高模量，表明已知的HFBII行为。从这些观察结果可以清楚地看出，在较低的HFBII/WPI比率下，富HFBII的畴的表面分离，包围着富WPI的2D相，随着HFBII比率的增加，这些畴的大小增加，它们变得相互连接，因此在fHFBII=0.6左右时，表面变得以HFBII为主。

3.2.吸附层

发泡系统的下一步是观察吸附层。与扩散层相反，表面成分未知；只有蛋白质的体积比是已知的。此外，表面成分可能会随时间而变化，因为除了界面上WPI可能发生的构象变化外，表面和本体之间的材料连续交换是可能的。

图3显示了表面压力随时间的变化。第一次∼100 s后，清洁表面后，屏障仍在膨胀（程序说明见第2.2.2节），而在实验开始后100 s至1000 s之间，表面积保持恒定，以允许吸附层形成并平衡。从1000秒开始，界面被压缩，因此表面压力增加。与在扩展层中观察到的情况类似（在一个周期内，时间和面积呈线性关系），纯HFBII的表面压力增加斜率远高于纯WPI。大约2500秒后，表面再次膨胀，导致表面压力降低。同样在混合系统中，表面压力在1000 s后趋于平稳。应注意1000 s后平衡表面压力的绝对值，因为在22 mN/m以上以HFBII为主的层的情况下，界面变得有弹性，在0秒清洁表面后，可能会出现皱纹，并且针重新进入表面。在清洁界面和针浸入界面之间，可能已经吸附了一些蛋白质（当使用吸附层时，与使用铺展层相比，校准表面张力并不容易，因为吸附实验并不像使用铺展层那样从清洁的纯水界面开始）然而，吸附过程中的曲线形状，压缩和膨胀提供了有关吸附层功能的重要信息。从1000秒开始，第一次压缩开始，在大约2500秒时，接口再次扩展。

现在，让我们讨论扩散和吸附HFBII和WPI层之间的差异（见图1和图3）。扩散层和吸附层的吸附等温线形状大致相似。主要区别在于记录开始时表面压力较高。对于铺展层，选择施加蛋白质的量，使施加后的表面压力在第一次压缩前上升至约1 mN/m。在吸附的情况下，界面上蛋白质的数量，以及表面压力取决于吸附速率。吸附速率取决于蛋白质在本体中的浓度及其表面活性。该浓度选择得相当高（0.1 mg/ml），因此吸附在界面上的蛋白质量不会显着影响整体蛋白质浓度。

同样在视觉观察中（见图5），观察到了与传播系统的相似性。照片是从朗缪尔槽中的吸附层和压缩层拍摄的。观察到，在HFBII分数为0.33及以上的吸附层中，会形成典型的HFBII褶皱，这与扩散层不同，在扩散层中，从fHFBII分数为0.75起观察到褶皱（重要的是要记住，第一个是体积中的蛋白质比率，第二个是界面处的蛋白质比率）。另一个区别是，在吸附系统中，皱纹更多地出现在屏障处的弯月面上，而在扩散系统中，皱纹出现在均匀分布在槽区的斑块中（见图2）。

图5。在液体中不同疏水组分的朗缪尔槽上，HFBII/WPI混合溶液的吸附层照片：a:fHFBII=1，B:fHFBII=0.67，C:fHFBII=0.5，D:fHFBII=0.33。

图4给出了纯系统和一个混合系统在几个压缩/膨胀循环期间的表面压力等温线。我们注意到，在该图中，HFBII和WPI的表面积按扩展系统曲线中弯曲点的出现比例缩放（图1）。已知这一点反映了表面中明显的紧密堆积转变[8]。第一次压缩导致的表面压力的初始上升可以转化为表观膨胀模量，类似于对铺展层所做的，尽管蛋白质的总量可能会因吸附而变化，因此在这种情况下，吸附和表面积是不可互换的。由于表面压力的绝对值是未知的，所以决定考虑在压缩时表面压力的第一个10 Mn/m的上升来计算模量。图7（上图）给出了表观模量与本体溶液中HFBII分数的函数关系。从图中可以看出，从HFBII分数为0.33或以上的情况来看，吸附层以HFBII为主。这与皱纹的出现是一致的（图5）。

图4。˘/A-纯HFBII、纯WPI及其1:10混合物的吸附系统的等温线，所有这些系统的总蛋白质浓度均为0.1 mg/ml。等温线包括第一个压缩/膨胀循环和5个滞后环。将HFBII和WPI的表面积缩放至摊铺系统曲线中弯曲点的出现，对应于表面的明显紧密堆积过渡（图1）。

有趣的是，将吸附层（图7，顶部）的过渡点与HFBII占主导地位的行为进行比较，前者大致介于HFBII（整体）0.2和0.3（图6）之间，后者大致位于0.6（表面）的扩散层（图2）之间。假设这种情况发生在大致相同的表面成分上，这将表明0.2 HFBII:WPI本体成分对应于界面处的0.6 HFBII:WPI，毫不奇怪地证实HFBII比WPI更具表面活性。当然，应该注意的是，吸附实验中存在的HFBII的绝对量高于扩散实验中的HFBII绝对量，并且由于来自块体的额外蛋白质吸附，界面处的比率可能会随着压缩/膨胀循环而改变，如下文所述，可能会形成多层。

图6。表观模量E是WPI和HFBII混合溶液中吸附层HFBII分数的函数。

当仔细观察混合吸附层（图4）的表面压力等温线时，很明显，˘/a曲线随着每个压缩循环向左移动（面积较小），而纯蛋白质的曲线在第一次膨胀/压缩循环后几乎没有变化，在第一次膨胀/压缩循环中，各层或多或少处于平衡状态。纯体系的行为可以用这样一个事实来解释：蛋白质实际上是不可逆地吸附在界面上的（从铺展层的实验中也可以清楚地看到）。在膨胀的前几个循环中，更多的蛋白质可以吸附在自由表面，直到在最大膨胀点达到“平衡”。当系统被压缩时，由于蛋白质不能解吸，各层被简单地压缩（对于WPI而言，部分表面展开），并且可能形成一种结构，WPII不能完全从界面解吸，而是垂直重新排列，并在富含HFBII的层下方形成第二层。这一假设用图7中的图表和下面的讨论加以说明。在接下来的膨胀周期中，一些新的蛋白质可以继续吸附，但由于现在表面浓度已经高于平衡体积浓度，没有新的蛋白质会被吸附。此外，表面下第二层和靠近开放区域的WPI可以“翻转”并填充膨胀间隙，比任何新的蛋白质从块体中吸附的速度都快。这样，就达到了一种稳定状态。

图7。重复压缩和膨胀后HFBII:WPI混合层结构形成示意图。请注意，乳清蛋白的主要成分BLG仅在此处显示。压缩：BLG的一部分从表面排出，形成一个子层。膨胀：BLG的一部分停留在亚表层，而另一部分可能重新吸附到主层。顶面存在HFBII的净浓度。

吸附混合系统的行为非常有趣，值得进一步讨论。˘/A等温线向左移动的事实表明，在逐渐膨胀和压缩后，该层变得越来越紧密，接近纯HFBII的表面覆盖。这似乎得到了以下事实的支持：压缩后的坡度增加，并且越来越接近HFBII的坡度，这再次表明层行为逐渐由HFBII主导。对此几乎没有可能的解释：（i）WPI在界面上的构象变化（HFBII更为刚性），这在纯体系中是不存在的，但当两种蛋白质混合时会以某种方式出现。然而，这是不可能的，否则我们也会在扩散层中看到它的迹象；（ii）界面处的拓扑重排，最初界面是2D WPI连续的，WPI占主导地位，有一些分散的HFBII 2D域。这些域将在压缩和扩展后逐渐互连，并形成HFBII连续网络（在2D中，双连续阶段在拓扑上是不可能的）。如果这种情况再次发生，我们希望在扩散层中看到类似的趋势，但事实并非如此（或在非常有限的程度上）；（iii）由于WPI在界面上的吸附/解吸，界面中蛋白质的组成发生变化，这同样不太可能，因为两种蛋白质的吸附能都很高，最后（iv）在界面上形成多层结构，其中顶层富含HFBII并占主导地位，而底层富含WPI并吸附到顶层。后者可能是因为即使HFBII分子的亲水部分仍然含有大量疏水氨基酸，因此也是相对疏水的，并且由于HFBII和WPI下面的静电斥力预计非常低，因为HFBII表面层的等电点接近中性，这是这些系统中的相关pH值[10]。如果为真，这将给出系统的中间配置状态，介于WPI在界面处完全吸附和完全解吸之间，具有非常高的能量差。我们还看到混合铺展层（见图1）情况下的这种行为相似，但这与体相中没有WPI的情况不太明显。

3.3.泡沫实验环境和压力循环

在前几段中，我们考虑了HFBII和WPI在空气/水界面的扩散和吸附层。在本节中，我们试图将蛋白质在界面上的行为与泡沫的形成和稳定性联系起来。在这里，当我们根据初始气泡尺寸来描述泡沫性时，应该注意，初始气泡尺寸取决于泡沫性和泡沫稳定性（形成后立即），因为在测量初始气泡尺寸之前，泡沫与0.5%黄原胶溶液混合。黄原胶为系统提供了微弱的表观屈服应力，足以阻止奶油化和气泡再发酵，因此我们只能研究随后的粗化过程[8]。

图8给出了以与图3相同的HFBII:WPI比率制备的两种泡沫的初始气泡尺寸。最重要的观察结果是，少量HFBII（来自fHFBII 0.03）在很大程度上影响泡沫的初始气泡尺寸。此外，似乎从WPI主导向HFBII主导的行为转变发生在fHFBII∼=0.2，对应于朗缪尔槽中吸附层中观察到的转变（图6）。

图3。吸附0.1 mg/ml HFBII和WPI期间的表面压力与时间的函数关系；包括第一次压缩/膨胀循环（左）和压缩和膨胀期间吸附的HFBII和WPI层的表面压力等温线。

图8。根据浊度扫描测量评估的环境充气泡沫和压力循环泡沫的初始气泡尺寸（用0.5%黄原胶稀释后）。

这表明，与铺展层相比，泡沫中的成分功能性更好地对应于吸附层，这是有道理的，因为在泡沫形成期间，蛋白质层是通过吸附而不是在气泡表面铺展形成的，当气泡通过搅拌器搅拌附近的高剪切区时，蛋白质层也会膨胀和收缩。最后的观察结果是，当空气/水界面以HFBII为主时，压力循环样品的初始气泡尺寸似乎比未进行压力循环的样品小。

气泡尺寸随时间的相对增加如图9所示，表示为d2（t）/d2（0）。考虑到环境充气样品的泡沫稳定性，对于纯HFBII系统，在本实验期间未发现平均气泡尺寸的显着变化，表明几乎不可能发生任何歧化。在纯WPI的情况下，可以发现气泡尺寸急剧增加，表明对歧化的稳定性较差。在混合情况下，随着fHFBII的增加，我们可以看到气泡尺寸稳定性增加的趋势。我们可以粗略地说，当fHFBII<0.2时，气泡大小的初始演化在很大程度上取决于WPI。然而，当fHFBII>0.2时，HFBII的存在控制泡沫稳定性。这与在朗缪尔槽中观察到的初始气泡大小和吸附层的趋势非常一致。

图9。使用TurbirScan根据气泡尺寸演变评估泡沫稳定性

对于0.03<fHFBII<0.2的泡沫中气泡尺寸的增加，观察到在初始粗化数小时后，曲线趋于平稳。在粗化过程中，小气泡的收缩和总气泡中较大气泡的增长导致泡沫总表面积的净减少。上述结果表明，气泡稳定性随着表面积的逐渐减小而增加，这与朗缪尔槽上吸附系统在大变形压缩/膨胀循环中观察到的行为一致。

4.结论

在朗缪尔槽上研究了空气/水界面上分散和吸附的WPI/HFBII层，其性质与泡沫的形成和稳定性有关。在扩散和吸附系统中，观察到模量随着表面或亚相中HFBII的分数逐渐增加，我们可以确定WPI主导行为和HFBII主导行为的区域。通过对混合表层皱纹的目视观察，进一步证实了HFBII的优势。

当比较扩散和吸附系统时，发现需要更高的HFBII分数才能在扩散层中获得HFBII主导行为，而不是吸附层（fHFBII分别为0.6和0.2）。此外，我们的结果表明，与扩散层相比，在连续的大规模压缩/膨胀循环中，吸附层中蛋白质的组成会发生变化。我们解释了扩散层和吸附层之间的差异，可能在界面处形成双层/多层，顶层较硬，主要由HFBII控制，底层较软，主要由WPI控制。这两层的作用类似于平行连接的粘弹性膜，整体表面性质由较强的富HFBII层控制。从真实泡沫的初始气泡尺寸及其抗粗化的长期稳定性数据来看，泡沫行为与吸附层中测量的表面膨胀特性密切相关。最后，我们观察到，在HFBII和WPI的混合体系中，粗化过程随着时间的推移逐渐趋于平稳，这进一步支持了我们关于气泡表面多层形成的假设。

致谢

作者衷心感谢Jeoffrey Jansen先生对Turbuscan实验的帮助。荷兰联合利华研发部的鲁本·阿诺多夫博士和英国科尔沃思联合利华研发部的安德鲁·考克斯博士因激发讨论而受到认可。这项工作由荷兰联合利华研发中心弗拉丁根提供资金和执行。