材料和方法

化学品

煤油和正十六烷 (99%) 是 Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany) 的产品。 菜籽油购自超市。 原油由 ENI Norge 提供。 苯并 (a) 芘粉末 (>96%) 和苯并 (a) 芘溶液（100 ng/μl 的环己烷溶液）购自 Sigma Aldrich（美国密苏里州）。 溶剂甲基叔丁基醚 (MTBE)、庚烷和环己烷是 Merck KGaA（德国达姆施塔特）的产品。 除非另有说明，否则所用化学品均为分析级。

沙子和海水样品

从沿挪威海岸线（包括朗格松、赫瓦勒、Tjøme、罗弗敦和奥斯陆港）的历史石油烃污染地点收集的沙子/土壤样本和海水用于分离烃降解细菌。

媒体

将微生物维持在 Marine Agar 2216 (Difco) 或 Marine Broth 2216 (Difco) 上。 煤油或其他特定碳源上的细菌生长在改良的 Bushnell Haas (MBH) 培养基上进行，该培养基含有（在 1 升海水中）： KH2PO4，（1 克）； K2HPO4，（1 克）； NH4NO3，（1 克）； MgSO4·7H2O（0.2克）； CaCl2·2H2O（0.02克）； FeCl3·6H2O（0.05 克）。[11]

烃类降解菌的分离

通过 0.2 µm 过滤器无菌过滤 400 ml 的海水。 然后将过滤器放入 250 毫升锥形烧瓶中，该烧瓶中预装了 50 毫升 MBH 肉汤。 对于土壤/沙子样品，使用 5 克土壤/沙子。 根据污染场地，补充 1% (w/w) 的过滤灭菌柴油或原油作为碳和能源。 然后将接种的烧瓶在 13°C、160 rpm 下培养 3 周，并在相同培养基中传代培养两次。 随后将第三次富集培养物在 MBH 中稀释到适当的稀释度，并铺在海洋琼脂 2216 上。这产生了 84 个具有不同形态的菌落。 选择不同的菌落并再次在海洋琼脂 2216 上划线以获得纯培养物。

筛选表面活性特性

从斯瓦尔巴群岛海滩沉积物中分离出的能够利用煤油作为碳源和能源的挪威渔业科学学院培养物保藏中心的 93 株新的碳氢化合物降解菌株与 93 株菌株一起筛选了 SAC 生产能力。 菌株在海洋琼脂平板上于 13°C 培养 1 周。 随后将每种分离物的单菌落接种在试管中，加入 3 ml MBH 培养基并补充有 1% (w/w) 葡萄糖或煤油。 将管在 13°C (180 rpm) 下用葡萄糖培养 1 周，用煤油培养 4 周。 通过离心（10,000 rpm 10 分钟）将细胞与培养液分离。 对完整培养物和无细胞上清液进行生物表面活性剂和乳化特性的测定，如下所述。

SAC 生产的光学畸变测定

从每个菌株的培养上清液中取出 100 µl 体积并加入到平底 96 微孔板中。 然后将这些板放在一张带有黑色网格的纸上并进行检查。 网格的光学畸变为 SAC 的存在提供了定性分析。 [12]

用于 SAC 生产的油扩散试验

将蒸馏水 (3 ml) 装入 24 孔微孔板的每个孔中。 将 10 μl 原油加入蒸馏水中，并将约 10 μl 细菌培养物逐渐加入油层中心。 如果培养物中存在 SAC，则油将被置换并形成清洁区。 还包括分别使用 10 µl 蒸馏水和 10 µl Tween 80 (0.1% w/w) 的阴性和阳性对照。 [13]

乳化试验

如 Batista 等人所述测量无细胞上清液的乳化活性。 [14]。 选择在初始定性筛选中产生稳定混浊乳液层的上清液进行定量乳化测定，在试管（φ 13 mm × 16 mm）中使用 5 ml 上清液和 5 ml 煤油。 然后将混合物涡旋2分钟并在室温下静置。 24 小时后估计相对乳液体积 (EV %) 与总液体体积。

表面张力和临界胶束浓度 (CMC) 测量

根据 Du Nouy 方法，使用 EZ-Piplus 张力计（摩登7，）测量培养物和培养物上清液的表面张力。 [15] 提取的 SAC（见下文）重新悬浮在蒸馏水中并稀释到不同的浓度。 测量稀释液的表面张力以确定CMC。 CMC 是表面张力值达到最低水平时 SAC 的最低浓度。

生物表面活性剂的生产和提取

SAC 阳性菌株在 50 ml 海洋肉汤中预培养 24 小时。 然后通过在 5°C 下以 4500 rpm 离心 20 分钟收获细胞，并用 MBH 培养基洗涤 3 次。 将细胞沉淀重新悬浮在 100 ml MBH 培养基中，该培养基补充有 2% (w/w) 过滤灭菌的煤油、正十六烷或高压灭菌的菜籽油。 将烧瓶在旋转振荡器中以 160 rpm 在 20°C 下孵育 7 天。

为了在静息细胞条件下生产 SAC，将细菌分离物在 50 ml 海洋肉汤中预培养 24 小时。 然后通过在 5°C 下以 4500 rpm 离心 20 分钟收获培养物，并用含有 K2HPO4 1 g 的磷酸盐缓冲液洗涤 3 次； KH2PO4 1 g 和 NaCl 19.7 g。 将细胞沉淀（0.6 g）重新悬浮在补充有 2% (w/w) 过滤灭菌煤油的 50 ml 磷酸盐缓冲液中，随后将细胞悬浮液在 160 rpm 和 20°C 下孵育 5 天。

根据 Kuyukina 等人的方法提取生物表面活性剂。 [16] 稍作修改。 将等体积的 MTBE 添加到培养物中。 将混合物在 45 kHz 下超声 5 分钟，随后在旋转振荡器上以 200 rpm、20°C 振荡 3 小时，然后在 4°C 下以 4500 rpm 离心 5 分钟以分离两相。 将顶部溶剂层转移到干净的烧杯中并在 37°C 下干燥。

16S rRNA基因序列分析

选定的分离株在 16°C 下在海洋肉汤中培养 24 小时。 对于 16S rRNA 基因扩增，使用 InstaGene 矩阵试剂盒（Bio-Rad，英国）按照制造商的说明分离细菌染色体 DNA。 16S rRNA 基因使用 PCR 方法用 1 U Taq DNA 聚合酶 (VWR) 和通用引物 27F (5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 和 1492R (5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT) 进行扩增。 根据制造商的方案，使用 BigDye 终止子试剂盒 3.1 版（Applied Biosystems）对 16S rRNA 基因进行测序，使用通用引物 515F（5' -GTGCCAGCAGCCGCGGTAA）。 PCR 测序后，使用 Applied Biosystems 3130xl 基因分析仪对样品进行测序。 使用 RDP (http://rdp.cme.msu.edu) 提供的 SEQMATCH 程序进行分类学分类。 使用国家生物技术信息中心 (NCBI) 的 BLAST 2.2.12 版检查序列同源性。 16S rRNA 基因序列以登录号提交给 GenBank。

正十六烷的生物降解

来自红球菌属的生物表面活性剂。 研究了菌株 LF-22 对正十六烷生物降解的影响。 将过滤除菌的正十六烷 (1 ml) 添加到 100 ml 高压灭菌的海水中，并补充有 KH2PO4 (1 gl-1)； K2HPO4 (1 gl-1 ); NH4NO3 (1 gl-1 ) 和 FeCl3·6H2O (0.05 gl-1 )。 将提取的生物表面活性剂以终浓度为 CMC 的两倍添加到烧瓶中。 Yarrowia spp. 的混合酵母培养物 LS-DO。 作为正十六烷降解剂接种在烧瓶中。 LS-DO 能够利用正十六烷和煤油作为唯一的碳源和能源。 样品 1 是仅包含正十六烷的对照（表 4）。 样品 2 含有正十六烷和生物表面活性剂。 样品 3 补充有正十六烷和耶氏酵母属。 LS-DO。 样品 4 与样品 3 相似，但添加了生物表面活性剂。 将烧瓶在 180 rpm、13°C 下孵育 17 天。 在开始和 13 天和 17 天后测量培养物在 600 nm 处的光密度、表面张力和培养物的正十六烷浓度。 使用分配重量法测量培养物中正十六烷的浓度。 [17]

海洋细菌中生物表面活性物质——摘要、介绍

海洋细菌中生物表面活性物质——材料和方法

海洋细菌中生物表面活性物质——结果和讨论

海洋细菌中生物表面活性物质——结论、致谢！