为了探明无机盐稳定化脂肪酶的潜在机理，该文以小麦胚芽脂肪酶为研究对象，基于界面酶学的分析方法，研究添加浓度介于1.0×10-9～1.0×10-2mol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+的氯化物对小麦胚芽脂肪酶存在的油-水界面特性的影响。结果表明，当小麦胚芽脂肪酶体系浓度为1.7×10-6mol/L时，一价金属中Na+更有利于抑制油-水界面的表面张力（P＜0.05），对麦胚脂肪酶存在时的油水界面特性影响也较大；二价金属离子Ca2+对界面张力的影响趋势与一价离子不同，在高浓度时反而增加界面张力；当油水界面上存在脂肪酶的催化底物（三油酸甘油酯）和产物（油酸）时，添加浓度分别为10-6、10-6、10-4和10-9mol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+均可一定程度上降低油水界面张力，从而降低麦胚脂肪酶的作用效果，三油酸甘油酯存在时Mg2+的作用效果最明显（P＜0.05），油酸存在时Na+的作用效果最明显（P＜0.05）。综上，无机盐金属离子主要通过影响麦胚脂肪酶在油水界面的聚集行为及底物结构状态起到钝化麦胚脂肪酶的作用，该结果可为麦胚脂肪酶存在时界面的活性调控及麦胚的稳定化处理提供参考。

0引言

小麦胚芽是小麦加工的主要副产物之一，约占整个小麦籽粒的2.5%～3.0%。小麦胚芽营养丰富，被誉为“人类营养的天然宝库”。全球每年5.5亿t小麦产量中，大约可产出100万t功能性油脂和300万t蛋白质，但目前有效利用率却不足10%，主要是因为小麦胚芽中含有丰富的脂肪酶，在其作用下脂肪极易水解，导致小麦胚芽的酸败变质，为此，小麦胚芽稳定化是当前备受关注的课题。

小麦胚芽脂肪酶（LA，lipase A）是一种两亲性且具有界面活性的蛋白分子，只能作用于油水界面，该界面不仅是LA催化反应的关键场所，也是调控LA催化活性的合适位点。多年来，学界关于油水界面的理解一直局限于所谓“界面性质”的模糊认识，并推测脂肪酶与底物之间的相互作用可能包括静电吸引，底物的取向性和水合作用等。直到最近，Reis应用生物物理学理论，才首次揭开了界面微环境与脂肪酶催化活性的内在关联。事实上，脂类酶促水解是典型的多相催化反应，其反应速率和方向取决于界面微环境的所有组成成分。界面组成所呈现出的特征及其与酶催化效率的关联性，不仅为今后研究脂肪酶界面催化反应提供了新方法，也为研究麦胚脂肪酶的钝化方法开辟了新的途径。

研究表明，全麦粉中添加一定量Na+，可抑制76.7%脂肪酶活力；Na+对膜结合脂肪酶活力抑制率达55%，由此可见，加入金属离子抑制剂可作为钝化LA的辅助手段。此外，LA本身并不能决定酶促反应的平衡常数，其催化水解效率依赖于LA的界面活性以及底物、产物以及抑制剂在界面的扩散速率与动态分布。Torcello-Gómez等研究发现，金属离子可与离子化脂肪酸特异性形成某种复合物，改变脂肪酸溶解性和油水界面的某些性质，进而影响脂肪酶催化活性。因此，在无机盐作用下，LA所处微环境发生改变，势必影响界面层（水相）对LA的吸附和底物在界面层（油相）的定位。此外，各种界面活性分子也会在界面层产生竞争，如甘油三酯水解产生具有界面活性的二酰甘油、单酰甘油等会占据界面层与LA分子发生竞争，或者通过分子间相互作用使LA构象发生变化。上述两种作用机制都可能对LA的催化效果产生影响。因此，对油水界面特性的深入研究与充分认识，将有助于发现新的LA活力调控方式。

目前，有关金属离子对LA影响作用的研究中，一般涉及无机盐对LA活性、结构等影响方面的研究，而金属离子是否会对麦胚LA存在时油水界面特性产生影响，进而影响LA的催化活性尚停留在推断阶段。基于上述现状，本研究基于界面酶学分析方法，研究不同浓度的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2对麦胚LA、麦胚LA+三油酸甘油酯和麦胚LA+油酸3种不同油水界面模型的影响，以期从界面特性角度分析Na+、K+、Ca2+、Mg2+4种金属离子对麦胚LA催化功能的影响机制，为小麦胚芽稳定化方法的建立提供理论研究依据。

1、材料与方法

1.1材料与仪器

麦胚LA（产品编号L3001）、单油酸甘油酯，购自美国Sigma有限公司；癸烷，纯度99%，购自英国Alfa Aesar A Johnson Matthey公司；油酸、三油酸甘油酯、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2均为分析纯，购自上海国药化学试剂有限公司。

界面张力仪，摩登7公司；AR-G2旋转流变仪，美国TA Instruments公司；ED-F12标准型加热水浴槽循环器，德国Julabo公司。

1.2试验方法

1.2.1界面张力测定

采用吊片法测定麦胚LA油水界面的张力。界面张力结果为3次测量的平均值，试验温度为25.0±0.1℃。计算公式如下：

F=mg+2γ(L+d)cosθ（1）

式中F为铂片所受拉力，N，m为铂片质量，kg；g为重力加速度，m/s2；L为铂片长度，m；d为铂片厚度，m；γ为表面张力，N/m；θ为接触角，(°)。由于d＜＜L，所以F=mg+2γLcosθ。

1.2.2界面流变性质的测定

利用配有Du Nouy环系统的AR-G2旋转流变仪进行测定，具体操作如下：1）将20 mL磷酸盐缓冲溶液加入样品杯；2）把盘放置在珀尔贴平板上的定位环内；3）降下机头直至环定位与液体上表面的平面；4）将约5 mL癸烷均匀地加入到水样表面，至完全浸没Du Nouy环；5）在振荡模式下，选择“Strain sweep step”，测试频率为1Hz时，油水界面的流变性质，选择G'（储能模量）和G''（损耗模量）呈线性变化区间内的应变（strain）值，进行后续测定。选择“Frequency sweep step”，测试25℃、特定Strain下、频率0.1～3 Hz区间内16个点的界面流变性质；6）程序设定完成后，测定界面剪切弹性模量和界面剪切黏度等。

1.2.3不同浓度麦胚LA存在的界面模型构建

以癸烷为油相、0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH值=7.0）为水相，建立油水界面模型，同时分别添加1.70×10-8～1.70×10-6mol/L的麦胚LA到水相，研究不同浓度的麦胚LA对油水界面张力和界面流变特性的影响。

1.2.4不同种类与浓度的无机盐对麦胚LA界面特性的影响

以NaCl、KCl、CaCl2、MgCl24种无机盐的形式向油水界面模型水相中分别添加4种金属离子，研究浓度介于1.0×10-9～1.0×10-2mol/L间的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2对麦胚LA界面张力和界面流变特性的影响。

1.2.5不同浓度三油酸甘油酯对界面组成与结构的影响

根据1.2.3的试验结果，固定磷酸盐缓冲溶液中麦胚LA浓度，设定油水界面模型油相中三油酸甘油酯的浓度分别为1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3和1×10-2mol/L，分别按照1.2.1、1.2.2中的方法测定界面张力、界面流变参数。分析不同浓度三油酸甘油酯对油水界面组成与结构的影响。

1.2.6不同浓度水解产物（油酸）对界面组成与结构的影响

根据1.2.3的试验结果，固定磷酸盐缓冲溶液中麦胚LA浓度，设定油水界面模型油相中油酸的浓度为5×10-6、5×10-5、5×10-4、5×10-3、5×10-2和5×10-1mol/L，分别按照1.2.1、1.2.2中的方法测定界面张力、界面流变参数。分析不同浓度水解产物对油水界面组成与结构的影响。

1.2.7底物或产物存在时，无机盐对麦胚LA界面特性的影响

参考1.2.3的试验结果，在每种无机盐的不同研究浓度范围内，选取对麦胚LA界面张力和界面流变性质影响较大的某一浓度，同时按照1.2.5、1.2.6的试验结果，选取对界面特性影响最大时的三油酸甘油酯和油酸的浓度，研究有底物或产物存在时，NaCl、KCl、CaCl2、MgCl24种无机盐对麦胚LA界面张力和界面流变特性的影响。

1.3统计方法

试验结果为3次重复测定结果的平均值。采用Minitab进行数据分析，数据间差异性以95%置信区间（P＜0.05）来说明。