2、结果与讨论

2.1β-甘露聚糖酶产生菌的筛选

以瓜尔胶为唯一碳源，不能利用瓜尔胶产生β-甘露聚糖酶的菌株就逐渐成为弱势菌群从而被淘汰。利用高通量筛选方法从样品中共筛选得到571株产β-甘露聚糖酶菌株，通过DNS法分别测定其所产β-甘露聚糖酶的酶活力，测定结果如表1所示，其中有40株菌株所产酶的酶活力较高。对这40株菌株进行100 mL体系扩大培养，分别在5和20℃下测定瓜尔胶溶液的粘度，发现其中6株菌株所产酶的低温降粘速度较快，分别编号为A2、O5、L10、H13、Q12和Q14，如图1所示。综上可知，菌株O5所产β-甘露聚糖酶的酶活力最高，达到208.9 U/mL；在5和20℃下降低瓜尔胶的粘度也是最快的。菌株O5经刚果红染色后，产生了明显的透明圈（图2A）；经100 mL体系发酵培养48 h后，可将1%（质量分数）的瓜尔胶几乎降解完全，培养基的粘度明显降低，从815.8 mPa∙s降低至67.2 mPa·s，降粘率大于90%（图2B），说明其中必然存在着降解瓜尔胶的微生物。因此，进一步对菌株O5进行形态观察和种属鉴定及后续研究。

表1已分离的40株菌所产β-甘露聚糖酶的酶活力

图1不同时间下瓜尔胶溶液的粘度

图2菌株O5的刚果红染色（A）及降解瓜尔胶特性（B）

2.2菌株O5的鉴定

形态学鉴定如图3所示，菌株O5在LB平板上呈灰绿色，表面光滑隆起，边缘不整齐；革兰氏染色鉴定为阴性；经扫描电子显微镜观察得，菌株O5为杆状菌，菌体长为1.5~2.0μm，宽为0.3~0.4μm。

图3菌株O5的形态学观察

利用16S rRNA基因测序对菌株O5进行鉴定，将测序结果通过NCBI数据库中的BLAST进行比对分析，发现菌株O5与假单胞菌的同源性最高，为99.87%。利用MEGA软件构建系统发育树（图4）。由图4可知，菌株O5和施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri M16-9-4位于进化树的同一分支中，亲缘关系最相近。综合形态特征鉴定，鉴定菌株O5为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri），命名为Pseudomonas stutzeri O5。

图4基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树

2.3β-甘露聚糖酶的酶学性质

菌株在含有甘露聚糖的固体培养基上生长，被诱导产生β-甘露聚糖酶后，会将菌落周围的多聚糖降解为寡糖，经过刚果红染色后产酶菌株的菌落周围就会产生清晰的透明圈，通过这种方法可以比较直观的观察菌株是否产β-甘露聚糖酶。但酶活力大小与透明圈的大小之间并不是严格的比例关系，故采用DNS法测定其产酶的酶活力大小。菌株O5在瓜尔胶固体培养基上生长，经刚果红染色后产生了明显的透明圈；且其只有在以甘露聚糖类物质为底物时才有还原糖的产生，以瓜尔胶为底物时，比活为347.4 U/mg，当以葡聚糖、果胶等为底物时，并没有测到酶活力，由此确定菌株O5所产酶为β-甘露聚糖酶ME-O5（ME-O5）。

温度对酶活力的影响如图5A所示。ME-O5的最适反应温度为50℃。据报道，大多数β-甘露聚糖酶的最适温度在40~65℃之间，低于或高于最适温度下大多数酶均不稳定，但其失活的速率不同。ME-O5在20~70℃范围内的相对酶活力均在80%以上，能够保持较高的酶活力；当温度超过70℃时，酶活力快速降低；当温度小于20℃时，酶活力虽然有所下降，但相对酶活力仍保持在60%以上。值得注意的是，在5、10和20℃下ME-O5分别具有约60%、约72%和约80%的相对酶活力。由此可见，ME-O5的温度作用范围广，低温下酶活力高。

图5温度、pH值对β-甘露聚糖酶酶活力及稳定性的影响

与已报道的一些低温酶相比，ME-O5在低温下能保持更高的相对酶活力。Zhou等从磷石矿渣中分离得到Sphingomonas sp.JB13，其所产的β-甘露聚糖酶的最适温度为40℃，在20℃时的相对酶活力约为55%，在10℃时约为20%。Huang等分离到一株高产β-甘露聚糖酶的Bacillus subtilis Bs5，其所产酶的最适温度为35℃，在20℃时能保持40%的相对酶活力。Pongsapipatana等从Klebsiella oxytoca KUB-CW2-3中克隆了β-甘露聚糖酶的编码基因，并通过大肠杆菌系统表达，得到甘露聚糖酶KMAN-2，其最适温度为30~50℃，在30℃时的相对酶活力约为60%。

由图5B可知，ME-O5在60℃热处理1 h，其残余酶活力保持在90%以上，具有良好的稳定性；但随着温度的升高，酶活力稳定性迅速下降，在70℃处理1 h，其酶活力保持在60%以上；当ME-O5在80℃时热处理30 min，能保持高于50%的酶活力，随着热处理时间的增加，酶活力继续下降，处理1 h时仅能维持大约20%的酶活力。由此可知，ME-O5在中温区域的热稳定性良好，但在高温区域（80℃以上）的热稳定性相对较差。

图5C是不同pH值条件下ME-O5的相对活性，结果表明，ME-O5的最适pH=7.0。当pH值在2.0~7.0时，随着pH值增大，ME-O5的相对酶活力增加，在pH=2.0时仍能保持43%的相对酶活力；当pH值在7.0~12.0时，随着pH值的继续增大，ME-O5的相对酶活力逐渐降低。但pH值在3.0~9.0范围内，ME-O5均能够维持70%以上的酶活力，具有一定的pH值适应性和较宽的pH值耐受范围。

将ME-O5分别与不同pH值的缓冲液混合，在50℃下孵育2 h，再与瓜尔胶底物溶液在最适条件下反应，测定其残余酶活力，结果如图5D所示。由图可知，ME-O5在pH值4.0~7.0范围内处理2 h，其残余酶活力均能保持在80%以上，说明该酶在弱酸条件下能够保持较高的酶活力且相对稳定。当pH值在8.0~9.0之间时，处理2 h仍能保持65%以上的残余酶活力，ME-O5的pH值稳定性良好。

2.4低温条件下ME-O5对瓜尔胶的降解

ME-O5对瓜尔胶的降粘结果如图6所示。在20℃条件下，ME-O5可使粘度超过1000 mPa·s的瓜尔胶溶液在3 h内粘度降低至5 mPa·s以下，使其粘度降低99%以上，在降低瓜尔胶粘度上表现优异；在5℃时，虽然降粘速度有所下降，但仍可在3 h内将粘度超过1000 mPa·s的瓜尔胶溶液的粘度降至100 mPa·s以内，在6 h内粘度降低至5 mPa·s以下，而空白组中的瓜尔胶溶液仍保持高粘度。由此可知，ME-O5表现出优良的低温降解瓜尔胶特性，能在短时间少用量的情况下，降解大量瓜尔胶底物，5℃时3 h内能使瓜尔胶溶液的粘度降低90%以上，降粘效果显著。You等研究发现来源于Enterobacter sp.N18的β-甘露聚糖酶在40℃时，3 h内可以将粘度大于1000 mPa·s的压裂液的粘度降低到5 mPa·s以下。Li等从Bacillus subtilis TD7中分离出一种低温β-甘露聚糖酶（YBMan），并在大肠杆菌中成功表达，在20℃时YBMan能在3 h内将瓜尔胶溶液的粘度从500 mPa·s降低到5 mPa·s以下。相较而言，ME-O5在低温下降解瓜尔胶更有优势，因此在以瓜尔胶为稠化剂的压裂液中，进一步探究ME-O5作为酶破胶剂的破胶性能。

图6 5、20℃时瓜尔胶溶液的粘度变化

2.5 ME-O5的破胶效果

2.5.1 ME-O5与水基压裂液添加剂的配伍性

在压裂过程中选择生物酶作为破胶剂，必须要保证酶与不同压裂液添加剂间的配伍性。按1.2.7小节中压裂液配方，将ME-O5分别与只含有KCl、Na2CO3、NaHCO3、戊二醛、硼砂和瓜尔胶添加剂的瓜尔胶溶液混合，破胶3 h后测定其破胶液的粘度。ME-O5在不同压裂液添加剂下的破胶情况如表2所示。由表2可知，各种压裂液添加剂与ME-O5均没有配伍禁忌，3 h后破胶液的粘度均下降至5 mPa·s以内，具有良好的配伍性。

表2 ME-O5与不同压裂液添加剂的配伍性

水基压裂液是由多种不同的添加剂按比例配成的非均质不稳定化学体系。随着压裂技术的不断发展，压裂液体系也在不断优化。在实际的压裂施工中，水基压裂液的配方由于施工环境的不同，存在着较大的差异。本压裂液配方选择油田中常用的瓜尔胶作为稠化剂；选择硼砂作为交联剂；为了稳定粘土矿物，选择KCl作为粘土稳定剂，以减少粘土矿物等对储层渗透率造成的伤害；为了使压裂液的性能更加稳定，便于控制，还加入了一定量的Na2CO3和NaHCO3，作为pH调节剂。此外，从低成本的角度考虑，选择戊二醛为杀菌剂，用来防止细菌滋生。

2.5.2粘度变化

按照配方配置压裂液，压裂液冻胶初始粘度为大于1000 mPa·s，加入1%（体积分数）的ME-O5，在不同温度下分别恒温反应3和6 h后测得其破胶液的粘度如图7所示。破胶3 h时，在10~60℃范围内，ME-O5均可将压裂液粘度降至5 mPa·s以下，彻底破胶（室温测定破胶液粘度低于5 mPa·s时视为彻底破胶）；但当温度在10℃以下或60℃以上时，酶的活性受到了影响，未能在3 h内破胶。当破胶时间延长到6 h时，在5~70℃内，压裂液能彻底破胶。由此表明ME-O5的在中低温范围内破胶效果好，在很大程度上弥补了化学破胶剂的破胶效果在低温时受到限制的问题。

图7不同温度下压裂液粘度随时间的变化

2.5.3表/界面张力及残渣量

在水力压裂过程中，仅压裂返排液的粘度低不能说明裂缝中的压裂液已返排干净，要综合考虑其破胶性能。压裂液在10、20和50℃条件下破胶3 h后，破胶液的表面张力、界面张力和残渣量的测定结果如表3所示。由表中数据可知，无论是在10、20还是50℃条件下，破胶液的表面张力均小于28 mN/m，界面张力均小于2 mN/m，残渣量均小于600 mg/L，达到或优于我国石油天然气行业标准SY/T 6376-2008《压裂液通用技术条件》的要求，SY/T 6376-2008中关于破胶性能的各项指标分别为：破胶时间≤720 min，破胶液表观粘度≤5.0 mPa·s，破胶液表面张力≤28.0 mN/m，破胶液与煤油界面张力≤2.0 mN/m，残渣量≤600 mg/L。这充分说明ME-O5在低温下的破胶效果良好，在低温油田压裂破胶方面表现出巨大的应用潜力。

表3破胶液的评价

3、结论

低温酶破胶剂对页岩油气藏开发过程中返排液的破胶及低温油藏压裂液的破胶至关重要。为此，本研究从油田压裂返排水和魔芋田地的混合样品中成功筛选到一株产低温β-甘露聚糖酶的菌株O5，其所产β-甘露聚糖酶（ME-O5）的最适温度为50℃，最适pH=7.0，对环境温度和酸碱度的耐受范围广；在5~20℃时仍能保持约60%以上的酶活力，低温活性优异。ME-O5与压裂液各添加剂的配伍性良好，在10、20和50℃下均能彻底破胶，残渣少，具有良好的低温破胶性能。ME-O5作为酶破胶剂具有专一性强、温度和pH作用范围宽、低温活性高等优点，弥补了化学破胶剂在低温下破胶效果差的弊端，在低温破胶领域有良好的应用潜力；且ME-O5可以快速降低压裂返排液的粘度，减少对自然环境造成的污染，在页岩油气藏和致密油气藏开发过程中具有重要的应用价值。

产低温β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低温油藏压裂液的破胶性能——摘要

产低温β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低温油藏压裂液的破胶性能——实验部分

产低温β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低温油藏压裂液的破胶性能——结果与讨论、结论