二、材料与方法

2.1. 材料

主要构成重建膜外叶的脂质购自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) 并按原样使用。 化合物 1- 棕榈酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (PC (16:0/22:6), Mw = 806.1, 纯度 > 99%) 和 1-(1Z-十八碳烯基)-2- 二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 PC (P-18:0/22:6, Mw = 818.2，纯度 > 99%) 作为氯仿溶液 (10 mg mL-1) 获得。 PC (16:0/22:6) 和 将 P-PC (18:0/22:6) 稀释以获得 1.25 mg mL-1 溶液。 来自绵羊毛的胆固醇（Chol，Mw = 711.0，纯度 > 98%）和 来自鸡蛋的鞘磷脂（SM，Mw = 386.7，纯度 > 98%） 以粉末形式获得。 两者都溶于氯仿 （HPLC 级，Carlo Erba，Val de Reuil，法国）浓度为 1.25 毫克毫升-1。

冷冻保护培养基由 Trizma 碱组成 (173.0 mM)，柠檬酸一水合物 (70.0 mM)，果糖 (56.0 mM)、甘油 (6.4%; v/v)，最后是抗生素（青霉素 G 钠 391 mg L−1，硫酸链霉素 856 mg L−1，林可霉素 盐酸盐 204 mg L−1，硫酸壮观霉素四水合物 585 mg L-1)（Sigma-Aldrich，St. Quentin Fallavier，法国）。 这 pH 值调整为 6.2，其渗透压约为 1300.0 摩尔渗透压。

2.2. 低密度脂蛋白的提取

从蛋黄中提取低密度脂蛋白 (LDL) 根据穆萨等人的协议。 [31]。 提取后，LDLs 的浓缩提取物（22 ± 0.5 g 相当于 8.36 g 干 LDL）在冷冻保护培养基中稀释 (100 毫升)。 低密度脂蛋白样品中蛋白质的定量 微 BCA 蛋白质测定试剂盒（Pierce，Thermoscientific，法国）提供 8.9 ± 1.0 毫克毫升-1。 低密度脂蛋白样品中 PC 磷脂的含量 由鸡蛋中 PC 的自然比例计算得出（18.4 g PC/100 g ofdry LDLs) 由 Antonet al. [33] 给出。它等于 15.4 g L−1 LDLs 样本。 低密度脂蛋白还包含一小部分 PE (PC/PE 6:1) [33]。

2.3. 收集血浆精液

牛精子是从一头 Prim Holstein 公牛身上收集的，并且 立即以 10,000 × g 离心两次以回收精液 上清液中的血浆。 我们样品的蛋白质含量 是 88.5 ± 5.0 mg mL-1，由微 BCA 蛋白确定 检测试剂盒（Pierce，Thermoscientific，法国）。

2.4. 脂质体的制备

脂质体由卵磷脂的提取物制成 使用迷你挤出机通过挤出在冷冻保护缓冲液中 来自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA)。 的提取物 卵磷脂由磷脂酰胆碱 (73%) 和 磷脂酰乙醇胺 (11%) 和少量成分，包括甘油三酯和鞘磷脂。 提取物在 冷冻保护缓冲液在脂质浓度为 分别为 3.90 mg mL-1 (C1)、7.28 mg mL-1 (C2)、14.56 mg mL-1 (C3) 和 21.84 mg mL-1 (C4)。 然后对分散液进行超声处理 在超声波浴（来自德国辛根 Elma 的 Elmasonic S 30H，功率为 275W）中持续 15 分钟。 最后，分散是 在挤出机中挤出（20 次通过 100 nm 膜）。 分布尺寸以 120 nm 为中心，Zeta 电位 值为 -6 mV。 在 BSP 存在下引入的脂质体量以重量表示（1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg 和 6.55 mg 脂质，用于脂质体分散体 C1、C2、C3 和 C4 分别）。 不确定度为 0.01 毫克。

2.5. 电泳

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 在还原条件下进行。 开创性的 将血浆溶解在由 Tris 0.5 M 组成的 pH 6.8 缓冲液中， SDS 10%、甘油 30% w/w 和溴酚蓝 0.4% 得到 1 mg mL-1 溶液。 9% 巯基乙醇 v/v 是 加入样品，涡旋混合，随后加热至 95°C 5 分钟。 那么，10 ? L 低范围分子量 标准（来自 Euromedex、Souffelweyersheim、 法国) 和 10 到 25 ? L 精浆装载在 15%- 聚丙烯酰胺凝胶（pH 6.8-Tris 0.5 M 和 SDS 0.10%）偶联 使用由 Tris 0.025 M、甘氨酸组成的 pH 8.3 迁移缓冲液 0.192 M，SDS 0.1%。 电泳在 20 mA 下进行， 凝胶用考马斯蓝 G250 溶液染色。 染色的 最后扫描凝胶并评估峰的强度 通过 Multi Gauge 软件（2.0 版，Fuji Photo Film Co., Ltd.， 日本）。

2.6. 表面活性测量

测量吉布斯膜（通过从精浆溶液扩散到空气-缓冲液界面而形成）的表面张力 在 15 孔板（铝底多孔板，带有 Teflon 轮辋）安装在朗缪尔天平（微槽 XL-LB，摩登7 Inc., Helsinki, Finland）配备高灵敏度传感器（使用合金线的威廉米法）。 该设备被放置在一个 温度控制区域固定在 23°C，并用纯蒸馏水校准（Milli-Q 系统，Millipore，美国）。 测量精度为 0.1 mN/m。 精浆被放置在 第一个孔然后在下一个孔中稀释 2 倍，依此类推（每个 井的体积为 300 ? L)。 重复测量 每种精浆提取物 4 次 (n = 2)。 结果是 表示为所有测量值的平均值。

在配备传感器的先前朗缪尔槽上测量蛋白质膜的压缩等温线 （微槽 XL-LB，摩登7 Inc.，赫尔辛基，）。 开创性的 血浆首先在冷冻保存的缓冲液中稀释（1/100） 并在缓冲液表面逐滴（50 升）展开。 这 在平衡 20 分钟后和在室温 (23°C) 下记录压缩等温线。

2.7. 外叶脂质结构域的重建 精子膜

精子外叶的脂质结构域 如前所述[35]重建膜。 这 Langmuir 槽 (302LL, Nima Technology, UK) 被插入一个 自制手套箱放在防震台上并冲洗 用氩气防止脂质氧化。 测量表面压力 使用由过滤器制成的 Wilhelmy 板，精度为 0.1 mN/m 纸（Whatman 的无灰 Whatman 色谱纸） International Ltd., Maidstone, Kent, UK) 连接到一个电 平衡。 环境温度固定在 20℃。 所有烧瓶 和注射器被引入手套箱，然后 在铺展单层之前用氩气脱气 1 小时。 朗缪尔天平的温度是恒温控制的 通过设置在 40 ℃ 的循环水系统。 真实温度 缓冲液表面的温度为 34°C。 子阶段包括 冷冻保护介质。 胆固醇、鞘磷脂、P-PC (18:0/22:6) 和 PC (16:0/22:6) 的氯仿溶液 适当的摩尔比（31:14:16:39）逐滴展开 到缓冲子阶段 25 ? L 微量注射器（精确到 0.5 ? L)（Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，瑞士）。 在压缩之前，让单层平衡 10 分钟 以 40 cm2/min 的屏障速度启动。 一旦达到目标压力 (25 mN/m)，压力就会保持不变 通过使用可移动障碍物调整表面积来保持恒定。 由于单层在 30 mN/m 下随时间不够稳定 这是与脂质堆积密度相关的薄膜压力 双层 [36]，我们将目标压力降低到 25 mN/m，其中 单层更稳定（见结果）。

一旦达到目标压力 (25 mN/m)， 在引入解决方案之前保持 1000 s 生物分子（低密度脂蛋白、BSP 或脂质体）进入亚相 弯针注射器。 针远离尖端弯曲 躺在槽的底部，以便注射 在压缩亚相之下执行。 等量的体积（每种添加剂 0.3 毫升）之前被移除 障碍。 注入生物分子后，面积变化 监测每个脂质分子并表示为变化 相对于初始值 (A/A= (A−A(t0)) × 100/A(t0))。 它有 被跟踪了 3000 秒，时间对应于处理 冷冻保存前的精液。 在这种恒压模式下， 生物分子插入脂质单层导致 通过增加而降低的薄膜压力的增加 表面积。 反之，表面积减少 生物分子导致脂质单层溶解在亚相中。 重复所有数据，偏差不超过5% 的表面积。

图 1. 从牛精液中分离的精浆的 SDS-PAGE 凝胶和 以不同浓度沉积：泳道 1:1 ? G; 车道 2:2 ? G; 车道 3:5 ? g和车道 4:10？ G。

2.8. 低温透射电子显微镜 (cryo-TEM)

使用cryoplunge冷冻固定装置（Gatan，USA）制备冷冻TEM观察标本，其中一滴 将水悬浮液沉积在辉光放电的多孔型碳涂层网格（Ted Pella Inc.，美国）上。 TEM 网格是 然后通过吸干含有样品的液滴来制备 支撑碳膜中的孔中保留有薄薄的液体层。 通过快速插入网格使液膜玻璃化 转化为由液氮冷却的液态乙烷。 玻璃化标本安装在 Gatan 910 标本架（Gatan，美国） 使用 CT-3500-cryotransfer 插入显微镜 系统（Gatan，美国）并用液氮冷却。 透射电镜图像 然后从保存在玻璃冰中的标本中获得 悬浮在支撑碳基板上的孔中。

在低剂量条件下观察样品 (<10 e-/A2)，-178 ℃，使用 JEM 1230 'Cryo' 显微镜（Jeol， Japan) 在 80 kV 下运行并配备了 LaB6 灯丝。 全部 显微照片记录在 Gatan 1.35K × 1.04K × 12 位 ES500W CCD 相机。 采集了 50 多张图像系列 对于来自多个样品制备的每个样品，具有不同的 放大倍数，以确保观察的良好重复性。

应用不同组装的磷脂酰胆碱对牛精浆蛋白的隔离——摘要、简介

应用不同组装的磷脂酰胆碱对牛精浆蛋白的隔离——材料与方法

应用不同组装的磷脂酰胆碱对牛精浆蛋白的隔离——结果与讨论

应用不同组装的磷脂酰胆碱对牛精浆蛋白的隔离——结论、致谢！